Ubikwitynacja białek, STUDIA, biologia komórki

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Tom 54 2005
Numer 2–3 (267–268)
Strony 133–148
B
ARBARA
G
RZELAKOWSKA
-S
ZTABERT
Zakład Biochemii Komórki
Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, PAN
ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa
e-mail b.grzelakowska@nencki.gov.pl
ZALEŻNA OD UBIKWITYNY DEGRADACJA BIAŁEK
NAGRODA NOBLA Z CHEMII W 2004 ROKU*
Metabolizm komórki ściśle zależy od po-
ziomu i aktywności wielu różnych białek,
które podlegają regulacji na poziomie trans-
krypcji, translacji, modyfikacji potranslacyj-
nych, a także zależą w bardzo dużym stopniu
od efektywności ich proteolizy nieodwracal-
nie degradującej białka. W komórkach eu-
kariotycznych występują dwa podstawowe
systemy degradacyjne - lizosomalny i pozali-
zosomalny. W systemie lizosomalnym degra-
dowane są przede wszystkim białka zewną-
trzkomórkowe dostające się do komórek na
przykład podczas endocytozy, czy też białka
wewnątrzkomórkowe, jeśli komórka poddana
jest silnemu stresowi, np. podczas głodzenia.
Natomiast pozalizosomalny układ proteoli-
tyczny, to zależny od ATP szlak ubikwityna/
proteasom, którego badania rozpoczęły się
w końcu lat 70. XX w. W układzie tym, jak
obecnie wiadomo, są degradowane, oprócz
białek strukturalnych i konstytutywnych, tak
ważne dla prawidłowego funkcjonowania ko-
mórek enzymy regulujące szlaki biosyntetycz-
ne, białka regulujące przebieg cyklu komór-
kowego, wiele czynników transkrypcyjnych,
białek kodowanych przez onkogeny i geny
supresorowe czy też białek biorących udział
w odpowiedzi immunologicznej. Szczególnie
duże zainteresowanie pozalizosomalnym ukła-
dem proteolitycznym rozpoczęło się w poło-
wie lat 80. minionego wieku, a jego kulmina-
cją jest przyznanie w 2004 r. jego
tion”
,
jak głosi werdykt Królewskiej Szwedz-
kiej Akademii Nauk,
zostali:
Irwin Rose
urodzony w Nowym Yorku
(1926), biochemik (PhD 1952), ponad 30 lat
pracujący w Fox Case Cancer Center w Fila-
delfii, od 1995 r. kontynuujący pracę nauko-
wą na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine,
członek National Academy of Sciences USA.
Avram Hershko
, urodzony w Karcag,
Węgry (1937), od 1950 r. obywatel Izraela,
doktor medycyny (MD 1965) i biochemii
(PhD 1969), od 1972 r. profesor w Instytu-
cie Badawczym Nauk Medycznych im. Ro-
dziny Rappaportów w Izraelskim Instytucie
Technologii (Technion) w Hajfie, laureat na-
grody Weizmana, nagrody Izraela, razem z A.
Varshavskim i A. Ciechanoverem nagrody im.
Alberta Laskera (2000), członek National Aca-
demy of Sciences USA.
Aaron Ciechanover
, urodzony w Hajfie
(1947), obywatel Izraela, doktor medycyny
(MD 1981), od początku lat 80. minionego
wieku profesor w Zakładzie Biochemii i
dy-
rektor
Instytutu Badawczego Nauk Medycz-
nych im. Rodziny Rappaportów w Izraelskim
Instytucie Technologii w Hajfie, laureat na-
grody Izraela oraz, wraz z A. Hershko i A.
Varshavskim, nagrody im. A. Laskera (2000).
Zasługą powyższych badaczy jest odkry-
cie i opisanie podstaw działania zależnej od
ubikwityny (i ATP) proteolizy białek, pro-
cesu precyzyjnie regulowanego i specyficz-
nego w stosunku do białkowego substratu,
jego lokalizacji komórkowej i momentu,
w którym ma nastąpić jego degradacja. Za-
*patrz także art.: B. G
ZELAKOWSKA
-S
ZTABERT
,
Nagroda Nobla z chemii za 2004 rok — docenienie kontrolowanej,
zależnej od ubikwityny, proteolitycznej degradacji białek
. Post. Biol. Kom. 32, 3–12, 2005.
odkryw-
com nagrody Nobla z dziedziny chemii.
Laureatami nagrody Nobla „
for the disco-
very of ubiquitin-mediated protein degrada-
134
B
ARBARA
G
RZELAKOWSKA
-S
ZTABERT
interesowania badawcze każdego z laure-
atów odzwierciedlają tytuły ich wykładów
noblowskich:
Irwin Rose „How ubiquitin chains are
made and unmade” (Jak powstaje i rozpada
się łańcuch poliubikwitylowy),
Avram Hershko „The ubiquitin system
for protein degradation and its roles in the
control of cell division” (Udział ubikwityny
w degradacji białek i jej rola w kontroli po-
działu komórki),
Aaron Ciechanover „Intracellular prote-
olysis — from a vague idea into the patient
bed” (Wewnątrzkomórkowa proteoliza — od
idei do łóżka pacjenta).
Obecnie I. Rose pracuje naukowo
w dziedzinie nie dotyczącej proteolizy bia-
łek. A. Hershko kontynuuje badania degra-
dacji takich istotnych regulatorów cyklu
komórkowego jak cyklina B i inhibitor
cyklu białko p27 oraz interesuje się me-
chanizmem działania enzymów przepro-
wadzających ubikwitylację białek. Badania
A. Ciechanovera dotyczą przede wszystkim
regulacji stabilności przez układ ubikwity-
na/proteasom czynników transkrypcyjnych
p53, c-Myc, NF
κ
B i MyoD oraz powiązań
pomiędzy proteolizą białek w omawianym
układzie a apoptozą komórek.
UBIKWITYLACJA BIAŁEK — HISTORIA I TERAŹNIEJSZOŚĆ
Początki badań tego problemu sięgają do-
świadczeń A. Hershko z końca lat 70. XX w.
i dotyczących degradacji enzymu — amino-
transferazy tyrozynowej oraz udziału w tym
procesie ATP. Konsekwencja i determinacja
A. Hershko w wyjaśnianiu, jak się wówczas
wydawało, paradoksu — konieczności udzia-
łu energii w wewnątrzkomórkowej degra-
dacji białek — doprowadziła do jego ścisłej
współpracy z A. Rose, a następnie z A. Cie-
chanoverem. Pracując wspólnie w laborato-
rium kierowanym przez Rose nad proteolizą
różnych białkowych substratów zachodzącą
w bezkomórkowych lizatach z retikulocytów
królika, badacze Ci zaproponowali w 1980
r. model czteroetapowej degradacji białek
(H
ERSHKO
i współaut. 1980). Etap I to dołą-
czenie do białka przeznaczonego do degrada-
cji niewielkiego globularnego białka nazwa-
nego APF-1 (ang. ATP-dependent proteolytic
factor) przez enzym — syntetazę, w procesie
wymagającym ATP. Etap II to korekcja „błęd-
nie” oznakowanego substratu poprzez usu-
nięcie APF-1 przez enzym izopeptydazę. Etap
III polegać miał na degradacji białka ozna-
kowanego APF-1 pod działaniem endopepty-
dazy (wielo-katalitycznej i wielo-funkcyjnej
proteazy) do peptydów połączonych z APF.
W ostatnim etapie IV, dochodziłoby do od-
szczepienia na drodze enzymatycznej APF-1
i dalszego rozkładu peptydów.
W latach 1981–1983 Rose, Hershko i Cie-
chanover prowadzili intensywne badania
zmierzające do udowodnienia słuszności za-
proponowanego wcześniej modelu, który, co
prawda w postaci mocno rozbudowanej, obo-
wiązuje do dzisiaj. Przede wszystkim wykaza-
li, że białko APF-1 jest identyczne z odkrytą
w 1975 r. ubikwityną, niewielkim, zbudowa-
nym z 76 aminokwasów białkiem globular-
nym. Stosując szereg metod biochemicznych,
w tym frakcjonowanie lizatów białkowych
i oznakowaną izotopem ubikwitynę, wyklu-
czyli jej działanie jako aktywatora syntetazy,
a opracowaną w laboratorium metodą immu-
nochemiczną pokazali dołączanie ubikwityny
do białkowego substratu (H
ERSHKO
i współ-
aut. 2000). Obecnie wiadomo, że ubikwityna
jest jednym z najbardziej konserwatywnych
białek komórkowych, które występuje w for-
mie wolnej lub związanej we wszystkich
organizmach eukariotycznych (P
IOTROWSKA
1993). Centrum aktywne ubikwityny stano-
wią reszty Leu-Arg-Gly-Gly obecne na karbok-
sylowym końcu łańcucha. W procesie kowa-
lencyjnego dołączenia ubikwityny do białka
mającego ulec degradacji C-końcowa glicyna
ubikwityny łączy się wiązaniem izopeptydo-
wym z grupą
ε
-aminową lizyny koniugowa-
nego białka, możliwe jest również enzyma-
tyczne przenoszenie jednej cząsteczki wolnej
ubikwityny na drugą. W cząsteczce ubikwity-
ny występują cztery reszty lizyny, na których
mogą formować się łańcuchy poliubikwitylo-
we. Obecnie wiadomo, że tylko utworzenie
łańcucha w połączeniu z lizyną w pozycji 48
ubikwityny skierowuje białko do degradacji,
zaś monoubikwitylacja białka lub tworzenie
łańcuchów poliubikwitylowych poprzez li-
zyny obecne w innych miejscach cząsteczki
ubikwityny ma przede wszystkim znaczenie
regulacyjne (W
EISSMAN
2001).
Nagroda Nobla z chemii w 2004 roku
135
W etapie I pierwotnego modelu, katalizo-
wanym przez syntetazę, działają, jak to udo-
wodnili Nobliści, nie jeden, a aż trzy enzymy,
których sekwencyjne działanie doprowadza
do ubikwitylacji białka (Ryc. 1). Są to enzym
aktywujący ubikwitynę (E1), enzym koniugu-
jący i przenoszący zaktywowaną ubikwitynę
(E2) oraz enzym zwany ligazą ubikwitylową
(E3), który bierze udział w rozpoznawaniu
substratu mającego ulec degradacji i dołącza-
niu do niego ubikwityny. Do dzisiaj poznano
zaledwie kilka enzymów E1, około dwudzie-
stu enzymów E2 i kilka klas ligaz ubikwi-
tylowych, do których zalicza się już blisko
1000 białek. Należy podkreślić, że w etapie
I tylko reakcja katalizowana przez E1, w któ-
rym tworzy się wysokoenergetyczne wiąza-
nie pomiędzy glicyną na C-końcu ubikwity-
ny a cysteiną obecną w centrum aktywnym
E1, wymaga energii pochodzącej z hydrolizy
ATP do AMP i pirofosforanu. Kolejny etap
to przeniesienie zaktywowanej w powyższy
sposób ubikwityny na enzym E2, z którego
następnie, bezpośrednio lub najczęściej przy
udziale ligaz ubikwitylowych E3, cząsteczka
ubikwityny zostaje przeniesiona na właściwy
białkowy substrat, a kilkukrotne powtórzenie
tej kaskady enzymatycznej prowadzi do utwo-
rzenia łańcucha zbudowanego z co najmniej
czterech reszt ubikwityny, rozpoznawanego
przez kompleks proteasomu. Deubikwitylację
substratu, także w przypadku jego błędnego
oznakowania (etap II) przeprowadzają zaś,
jak opisano poniżej, enzymy deubikwitylują-
ce należące do coraz bardziej powiększającej
się rodziny hydrolaz i izopeptydaz (C
HUNG
i B
AEK
1999, W
ING
2003, G
UTERMAN
i G
LICK
-
MAN
2004).
Rozszyfrowano już obecnie endopeptyda-
zy degradujące białka oznakowane ubikwity-
ną (etap III). Proces ten zachodzi w prote-
asomie 26S, kompleksie białkowym złożonym
z wielu podjednostek, charakteryzującym się
szerokim spektrum aktywności proteolitycz-
nej. Zbudowany jest z dwóch podstawowych
subkompleksów: cylindrycznego rdzenia
20S o aktywności proteolitycznej (podjed-
nostki
α
i
β
) oraz dwóch podjednostek re-
gulatorowych 19S (V
OGES
i współaut. 1999,
Z
WICKL
i współaut. 2001, F
ÖRSTER
i H
ILL
2003,
P
ICKART
i C
OHEN
2004). Przed dostaniem się
do wnętrza proteasomu 26S, ale już po roz-
poznaniu przez określone białka tworzące
podjednostkę 19S bądź inne białka współ-
działające (ang. shuttle proteins) (H
ARTMAN
-
-P
ETERSEN
i G
ORDON
2004, M
ADURA
2004, V
ER
-
MA
i współaut. 2004a), enzymy deubikwitylu-
jące odszczepiają łańcuch poliubikwitylowy
od białkowego substratu. Dzięki temu staje
się możliwe jego rozfałdowanie (przy udzia-
le ATP-az podjednostki 19S) i proteolityczna
degradacja w proteasomie do krótkich pep-
tydów i aminokwasów (V
ERMA
i współaut.
2002). Odłączony łańcuch ubikwitylowy jest
następnie degradowany, a uwolnione czą-
steczki ubikwityny ponownie wprowadzone
do obiegu.
Trzeba jednak zauważyć, że w proteaso-
mie 26S mogą także niekiedy być degrado-
wane białka nieoznakowane uprzednio ubi-
kwityną. Klasycznym przykładem jest enzym
— dekarboksylaza ornitynowa, kluczowy en-
zym w biosyntezie polikationów komórko-
wych, poliamin (M
ANTEUFFEL
-C
YMBOROWSKA
1996), także w pewnych warunkach białko
p21, jeden z inhibitorów cyklu komórkowe-
go (T
OUITOU
i współaut. 2001, B
ORNSTEIN
i współaut. 2003), a także prawdopodobnie
i inne białka. Tak w uproszczonej postaci
przedstawia się schemat ubikwitylacji bia-
łek przedstawiany od szeregu lat w licznych
opracowaniach przeglądowych (np. C
IECHA
-
NOVER
i współaut. 2000, W
EISSMAN
2001, P
IC
-
KART
2001, W
ILKINSON
2004), także w pol-
skich czasopismach biologicznych (P
IOTROW
-
SKA
1993; W
ÓJCIK
1995; G
RZELAKOWSKA
-S
ZTA
-
BERT
2002a, b).
Klasyczna, najwcześniej poznana rola ubi-
kwitylacji polega na miejscowo- i czasowo-
-specyficznym oznakowywaniu białek prze-
znaczonych do degradacji. Należy sobie jed-
nak zdawać sprawę, że ubikwitylacja białka
nie zawsze musi przesądzać o jego degrada-
cji. Mono-lub multiubikwitylacja (bez two-
rzenia łańcucha) białek, a także tworzenie
łańcuchów na lizynie innej niż w pozycji 48,
może być sygnałem do endocytozy białek,
ich transportu do lizosomów lub wakuoli,
może regulować przemieszczanie się białek
pomiędzy jądrem a cytoplazmą, jak również
regulować działanie wielu białek uczestniczą-
cych w różnych procesach metabolicznych
(H
AGLUND
i współaut. 2003, S
CHNELL
i H
ICKE
2003, S
HCHERBIK
i H
AINES
2004). Omówienie
tych zagadnień przekracza ramy tego opraco-
wania, już jednak ich wyliczenie wskazuje, że
proces ubikwitylacji może dorównywać pod
względem znaczenia procesowi fosforylacji.
Ubikwitylacja jest bowiem, podobnie jak fos-
forylacja, procesem szybkim, do pewnego
momentu odwracalnym, podlega niezmiernie
precyzyjnej regulacji i dotyczy bardzo wielu
białek biorących udział we wszystkich prak-
tycznie procesach istotnych dla prawidłowe-
136
B
ARBARA
G
RZELAKOWSKA
-S
ZTABERT
go funkcjonowania komórek. Zdaniem wielu
biologów ubikwitynę można zatem traktować
jako jeden z podstawowych regulatorów me-
tabolizmu komórkowego (F
INLEY
i współaut.
2004). Należy dodać, że w komórkach ziden-
tyfikowano już także wiele białek pokrew-
nych ubikwitynie, które również biorą udział
w wielu procesach regulacyjnych, a ich dołą-
czanie do białek jest równie złożone jak do-
łączanie ubikwityny (S
CHWARTZ
i H
OCHSTRAS
-
SER
2003).
Jak już wspomniano, ostatni etap ubikwi-
tylacji białek — rozpoznanie białka przezna-
czonego do degradacji i zbudowanie na nim
łańcucha poliubikwitylowego — odbywa się
przy udziale ligaz ubikwitylowych, które sta-
nowią najliczniejszą grupę spośród enzymów
uczestniczących w ubikwitylacji białek. W dal-
szej części tego opracowania skoncentruję
się na krótkim omówieniu budowy i regula-
cji działania ligaz ubikwitylowych, biorących
udział w regulacji cyklu komórkowego. Moją
arbitralną decyzję o przedstawieniu tej wła-
śnie grupy enzymów uczestniczących w ubi-
kwitylacji usprawiedliwia fakt, że stosunko-
wo najwcześniej poznano ich podstawową
budowę i degradowane substraty, którymi są
przede wszystkim białka regulatorowe cyklu
komórkowego (V
EW
2001, G
RZELAKOWSKA
-
-S
ZTABERT
2002a), a w badaniach mechani-
zmów ich degradacji nadal bardzo aktywnie
uczestniczy Noblista A. Hershko. Złożoność
mechanizmów prowadzących do degradacji
regulatorów cyklu omówię na przykładach
degradacji kilku białek: białka p27 — inhibi-
tora kinaz cyklino-zależnych (Cdk), fosfatazy
Cdc25 — enzymu decydującego o aktywności
wszystkich kinaz cyklino-zależnych (za opi-
sanie i udokumentowanie udziału kinaz Cdk
w regulacji cyklu komórkowego L. Hartwell,
P. Nurse i T. Hunt otrzymali nagrodę Nobla
w 2001 r.) oraz sekuryny — białka decydu-
jącego o kohezji chromatyd. Wskażę także
na konsekwencje zaburzeń funkcjonowania
układu ubikwityna/proteasom w patogenezie
wielu schorzeń.
LIGAZY UBIKWITYLOWE — BUDOWA, REGULACJA DZIAŁANIA, SUBSTRATY
BUDOWA LIGAZ UBIKWITYLOWYCH
Ligazy ubikwitylowe są bądź wielopo-
djednostkowymi kompleksami białkowymi,
w których określone podjednostki biorą
udział w rozpoznaniu substratu i dołącza-
niu do niego łańcucha poliubikwitylowego
(dzięki interakcji z enzymem E2) bądź też są
pojedynczymi polipeptydami, w których spe-
cyficzne fragmenty cząsteczki pełnią tę funk-
cję. Wyróżnia się obecnie dwie podstawowe
klasy tych enzymów — ligazy z domeną RING
finger (ang. really interesting new gene), ka-
talizujące bezpośrednie przeniesienie na sub-
strat zaktywowanej i powiązanej z enzymem
E2 ubikwityny oraz ligazy z domeną HECT
(ang. homologous to the E6-AP C-terminus),
w których przed ostatecznym dołączeniem
ubikwityny do właściwego substratu docho-
dzi do przeniesienia zaktywowanej ubikwity-
ny z enzymu E2 na ligazę ubikwitylową E3.
W proteolizie regulatorów cyklu komórko-
wego biorą udział przede wszystkim ligazy
E3 z domeną RING finger (Ryc. 2). Są nimi
wielopodjednostkowe ligazy SCF i APC oraz
monomeryczna ligaza CHFR, których budo-
wę i działanie ostatnio omówiono na łamach
polskich czasopism (G
RZELAKOWSKA
-S
ZTABERT
2002a, 2004). Dlatego teraz przypomnę tyl-
ko podstawowe informacje o tych enzymach,
a szerzej omówię poznane ostatnio mechani-
zmy regulacji ich działania.
Ligazy typu SCF
(ang. Skp1-cullin-F-box-
-ROC1) zbudowane są z co najmniej 4 pod-
jednostek (Ryc. 2A). Największą podjednost-
ką jest jedno z białek z rodziny kullin (Cul
1–7), tworzące pomost, na którym dochodzi
do współdziałania z innymi podjednostkami
kompleksu. Końcowa globularna domena
kulliny wiąże się z podjednostką zawierającą
domenę RING finger,
białkiem Rbx1/ROC1
(ang. regulator of cullin), o strukturze zbli-
żonej do struktury palca cynkowego, zaan-
gażowanym w rekrutację enzymu E2 skon-
jugowanego z ubikwityną, i, jak się obecnie
przypuszcza, w hydrolizę wysokoenergetycz-
nego wiązania tioestrowego pomiędzy E2
a ubikwityną. N-końcowy fragment kulliny 1,
a także kulliny 7, wiąże podjednostkę Skp1
(ang. S-phase kinase associated protein 1),
stanowiącą łącznik pomiędzy kulliną a białka-
mi Fbp (ang. F-box proteins). W przypadku
ligaz typu SCF z kullinami innymi niż kulli-
na 1, zamiast białek Skp 1 i białek Fbp, wy-
stępują białka pokrewne pełniące podobne
funkcje (K
REK
2003, G
UARDAVACCARO
i P
AGA
-
NO
2004).
Białka Fbp rozpoznają i wiążą białka ma-
jące ulec ubikwitylacji, charakteryzuje je za-
Nagroda Nobla z chemii w 2004 roku
137
Ryc. 1. Schemat działania układu ubikwityna/proteasom.
E1 — enzym aktywujący ubikwitynę, E2 — enzym konjugujący i przenoszący ubikwitynę, E3 — ligaza ubikwi-
tylowa.
wsze obecność 40-aminokwasowej sekwencji
tzw. „F-box” oraz specyficznych sekwencji ta-
kich jak WD40 czy też LRR (ang. leucine rich
repeat), które biorą udział w interakcjach
białko-białko (C
RAIG
i T
YERS
1999, C
ARDOZO
i P
AGANO
2004). Mutacje i/lub amplifikacje
kodujących je genów spotykane są w wie-
lu komórkach nowotworowych, jak również
w mięśniach ulegających atrofii. Białka te są
wysoce niestabilne, a degradacja przynajm-
niej niektórych z nich następuje w proteaso-
mie 26S. Białka Fbp występują praktycznie
we wszystkich badanych organizmach, w ko-
mórkach ssaków jest ich prawdopodobnie
kilkaset. Powszechność i liczebność podjed-
nostek w ligazach typu SCF powoduje, że
mogą być tworzone różne kompleksy tych
enzymów o wybiórczej specyficzności w sto-
Ryc. 2. Przykłady ligaz ubikwitylowych z domeną RING finger (RF).
Oligomeryczne ligazy typu SCF (A) i APC/C (B). C — monomeryczna ligaza CHFR; zaznaczono podstawowe
podjednostki lub domeny, których działanie opisano w tekście.
  [ Pobierz całość w formacie PDF ]

  • zanotowane.pl
  • doc.pisz.pl
  • pdf.pisz.pl
  • emaginacja.xlx.pl

    •